Functional analysis of ZapA : keeping the one ring together

De voortplanting van E. coli is een ingewikkeld proces dat nauwkeurige
samenwerking van verschillende grote eiwitcomplexen, zoals het elangosoom,
vereist. Het eigenlijke celdelings proces wordt uitgevoerd door een eiwit complex
dat het divisoom wordt genoemd en dat uit tenminste 14 eiwitten bestaat. De functie
van de meeste van deze divisomale eiwitten is nog steeds onbekend, maar in dit
proefschrift staan de pogingen beschreven die gedaan zijn om enige aanwijzingen te
verzamelen wat betreft de functie van ZapA, een Z-ring stabilisator. Zo is gevonden
dat, in E. coli, de localisatie van ZapA alleen afhankelijk is van FtsZ. Verder is door
het bepalen van het tijdstip van de localisatie van ZapA gevonden dat ZapA
tegelijkertijd, maar onafhankelijk van, FtsA en ZipA localiseert (Hoofdstuk 2).
Verrassend genoeg is tijdens het onderzoek gebleken dat ZapA en FtsZ ook
localiseren als zogenoemde ‘spots’ die zich op willekeurige plekken in de cel
bevinden (Hoofdstuk 3). De FtsZ en ZapA spots co-localiseren niet, werden alleen
in jonge cellen gevonden en (dis)assembleerden na verloop van tijd. Aangezien FtsZ
kan polymeriseren, is het aannemelijk dat de FtsZ spots simpelweg FtsZ
protofilamenten zijn die (dis)assembleren (Hoofdstuk 3). In het geval van ZapA is er
echter geen simpele verklaring voor de spots aangezien uit in vitro experimenten is
gebleken dat ZapA geen grotere oligomeren kan vormen dan tetrameren (Hoofdstuk
4). Uit een schatting van het aantal ZapA moleculen per spot blijkt dat er tenminste
tientallen moleculen in een spot aanwezig zijn (Hoofdstuk 3) en daarom is het
aannemelijk dat een onbekend eiwit met ZapA een groot complex vormt. Het nut
van ergelijk complex vorming is nog onduidelijk.
Om meer inzicht te verwerven in het effect dat ZapA heeft op FtsZ
protofilamenten, zijn er verschillende in vitro experimenten uitgevoerd (Hoofdstuk
4), waaruit is gebeleken dat ZapA de polymerisatie van FtsZ bevordert en dat het
FtsZ polymeren stabiliseert, maar alleen onder omstandigheden waaronder FtsZ
protofilamenten al worden gestabiliseert, zoals in de aanwezigheid van 10 mM
MgCl2. De mate van stabilisatie bleek daarbij af te hangen van de pH, in de zin dat,
bij een pH van 7.5 de stabiliteit van de FtsZ protofilamenten groter was in
vergelijking met experimenten zonder ZapA, maar lager dan in experimenten
uitgevoerd bij een pH van 6.5.
Hoe ZapA de FtsZ polymeren stabiliseert is nog steeds niet duidelijk, vooral
gezien het feit dat ZapA geen effect heeft op de GTPase activiteit van FtsZ onder
biologisch relevante omstandigheden. Alleen in aanwezigheid van ZapA en 10 mM
MgCl2 werden arrays van FtsZ polymeren waargenomen. Deze arrays bestonden uit
parallel gerangschikte protofilamenten met voldoende ruimte voor de ZapA
tetrameer ertussen. Verder zijn dubbele FtsZ filamenten waargenomen die een dikte
hadden die overeenkomt met de lengte van de ZapA tetrameer.
Door middel van analytische ultracentrifugatie is vastgesteld dat ZapA als
een tetrameer aanwezig is onder alle geteste experimentele condities, wat
overeenkomt met eerder gepubliceerde resultaten, waaronder een dissociatie
constante van 320 nM voor de ZapA tetrameer. Deze data vormen een sterke
indicatie dat ZapA ook in vivo als een tetrameer aanwezig is.
Verrassend genoeg bleek dat een zapA deletie mutant een milde morfologie
had wanneer deze snel groeide, maar niet wanneer deze langzaam groeide
(Hoofdstuk 5). Snel groeiende cellen van de ZapA deletie stam waren deels
filamenteus en hadden geen Z-ring op elke mogelijke delings plek, hoewel geen
vertraging in de localisatie van FtsZ werd gevonden. Echter, de laat localiserende
divisomale eiwitten localiseerden wel vertraagd, hetgeen een aanwijzing is dat er
een probleem is met de assemblage van het divisoom. Aangezien algemeen wordt
aangenomen dat de vroeg localiserende divisomale eiwitten betrokken zijn bij de
stabilisatie van de Z-ring, is het waarschijnlijk dat het Min systeem en het nucleoid
occlusion systeem, die beide de FtsZ protofilamenten destabiliseren, niet
gemakkelijk overwonnen kunnen worden in de afwezigheid van ZapA (Hoofdstuk
5). Wanneer de Z-ring volledig gevormd was, werden er geen afwijkingen in de
dynamiek van de ring waargenomen met behulp van FRAP experimenten
(Hoofdstuk 5).
Bij het bestuderen van het effect van aztreonam op de remming van FtsI werd
duidelijk dat de vroeg localiserende eiwitten zich in het midden van de cel
ophoopten en dat gedurende de eerste twee massa verdubbelingen geen nieuwe
ringen gevormd konden worden. Deze blokkade in de formatie van nieuwe ringen
kon alleen door overproductie van FtsZ en FtsA overwonnen worden. Echter, de laat
localiserende eiwitten localiseerden normaal en alleen in het midden van de cel,
maar hoopten zich daar niet op (Hoofdstuk 6). Het gebrek aan disassemblage van het
divisoom kan, direct of indirect, het gevolg zijn van een gebrek aan transpeptidase
activiteit van FtsI waardoor een conformationele verandering in de peptidoglycan
laag niet plaats vond, welke benodigd is voor het destabiliseren van het divisoom
zodat het zich kan aanpassen aan de veranderende omgeving van de constricterende
cel. Een tweede model gaat ook uit van een conformationele verandering, maar nu in
FtsI zelf. Als gevolg van deze verandering vindt er geen dissociatie van de
divisomale eiwitten plaats waardoor de reorganisatie van het divisoom ook niet
plaats vindt.
Op basis van de data die in dit proefschrift beschreven staan, kan
geconcludeerd worden dat ZapA tetrameren de FtsZ protofilamenten, die al
enigszins gestabiliseerd zijn en zich dicht bij elkaar bevinden, cross-linkt zodat een
Z-ring gevormd kan worden. Om vroegtijdige Z-ring formatie te voorkomen, crosslinkt
ZapA geen protofilamenten die niet gestabiliseert zijn en zich niet in de buurt
van een ander FtsZ polymeer bevinden. Wanneer het divisoom zich assembleert,
localiseren ZapA en de andere vroeg localiserende celdelings eiwitten aan de Z-ring
zodat deze gestabiliseert wordt. Deze stabilisaite vindt vermoedelijk alleen
gedurende de formatie van de Z-ring plaats.